Microscópio Gigapixel de mesa: 10 etapas (com imagens)

2024 Autor: John Day | [email protected]. Última modificação: 2024-01-30 11:37

Em microscópios ópticos, há um compromisso fundamental entre o campo de visão e a resolução: quanto mais preciso o detalhe, menor é a região capturada pelo microscópio. Uma maneira de superar essa limitação é traduzir a amostra e adquirir imagens em um campo de visão maior. A ideia básica é juntar muitas imagens de alta resolução para formar um grande FOV. Nessas imagens, você pode ver tanto a amostra completa quanto os detalhes de qualquer parte da amostra. O resultado é uma imagem que consiste em cerca de um bilhão de pixels, muito maior em comparação com as fotos tiradas por um dSLR ou smartphone, que normalmente têm cerca de 10 a 50 milhões de pixels. Confira essas paisagens de gigapixel para uma demonstração impressionante da enorme quantidade de informações nessas imagens.

Neste instrutível, irei abordar como construir um microscópio capaz de gerar imagens de um campo de visão de 90 mm x 60 mm com pixels correspondentes a 2μm na amostra (embora eu ache que a resolução provavelmente esteja mais próxima de 15μm). O sistema usa lentes de câmera, mas o mesmo conceito pode ser aplicado usando objetivas de microscópio para obter uma resolução ainda mais precisa.

Eu carreguei as imagens em gigapixel que adquiri com o microscópio no EasyZoom:

Imagem da revista National Geographic de 1970

Toalha de mesa de crochê que minha esposa fez

Eletrônicos diversos

Outros recursos:

Tutoriais de microscopia óptica:

Resolução óptica:

Além da costura de imagens, o progresso recente em imagens computacionais torna possível a microscopia gigapixel, mesmo sem mover a amostra!

Etapa 1: Lista de suprimentos

Materiais:

1. Nikon dSLR (usei minha Nikon D5000)

2. Lente de distância focal de 28 mm com rosca de 52 mm

3. Lente de distância focal de 80 mm com rosca de 58 mm

4. Acoplador reverso de 52 mm a 58 mm

5. Tripé

6. Sete folhas de madeira compensada de 3 mm de espessura

7. Arduino Nano

8. Dois H-bridge L9110

9. Dois emissores IR

10. Dois receptores IR

11. Botão de pressão

12. Dois resistores de 2,2 kOhm

13. Dois resistores de 150 ohm

14. Um resistor de 1kOhm

15. Liberação remota para câmera Nikon

16. Quadro preto

17. Kit de hardware:

18. Dois motores de passo (usei o motor de passo bipolar Nema 17 3,5 V 1A)

19. Dois parafusos de avanço de 2 mm

20. Quatro blocos de travesseiro

21. Duas porcas de parafuso de avanço

22. Bucha deslizante de dois rolamentos e eixos lineares de 200 mm:

23. Fonte de alimentação 5V:

24. Arame enrolado

Ferramentas:

1. Cortador a laser

2. impressora 3D

3. Chaves Allen

4. Cortadores de fio

5. Ferramenta de enrolamento de arame

Etapa 2: Visão geral do sistema

Para traduzir a amostra, dois motores de passo alinhados em direções ortogonais movem um estágio nas direções xey. Os motores são controlados usando duas pontes H e um Arduino. Um sensor IR posicionado na base do motor de passo é usado para zerar os estágios, de forma que eles não colidam com nenhuma das extremidades dos blocos. Um microscópio digital é posicionado acima do estágio XY.

Assim que a amostra estiver posicionada e o palco centralizado, você pressiona um botão para iniciar a aquisição. Os motores movem o palco para o canto esquerdo inferior e a câmera é acionada. Os motores então traduzem a amostra em pequenos passos, à medida que a câmera tira uma foto de cada posição.

Depois que todas as imagens são tiradas, as imagens são costuradas para formar uma imagem gigapixel.

Etapa 3: Montagem do microscópio

Fiz um microscópio de baixa ampliação com uma dSLR (Nikon 5000), uma lente Nikon 28mm f / 2.8 e uma lente zoom Nikon 28-80mm. A lente de zoom foi ajustada para uma distância focal igual a 80 mm. O conjunto das duas lentes atua como uma lente de tubo de microscópio e uma lente objetiva. A ampliação total é a proporção das distâncias focais, em torno de 3X. Essas lentes não foram projetadas para essa configuração, portanto, para fazer a luz se propagar como um microscópio, é necessário posicionar um batente de abertura entre as duas lentes.

Primeiro, monte a lente de maior distância focal na câmera. Corte um círculo em uma cartolina preta com um diâmetro aproximadamente do tamanho da superfície frontal da lente. Em seguida, corte um pequeno círculo no meio (escolhi cerca de 3 mm de diâmetro). O tamanho do círculo determinará a quantidade de luz que entra no sistema, também chamada de abertura numérica (NA). O NA determina a resolução lateral do sistema para microscópios bem projetados. Então, por que não usar um NA alto para esta configuração? Bem, existem duas razões principais. Em primeiro lugar, conforme o NA aumenta, as aberrações ópticas do sistema se tornam mais proeminentes e limitarão a resolução do sistema. Em uma configuração não convencional como essa, provavelmente será o caso, portanto, aumentar o NA eventualmente não ajudará mais a melhorar a resolução. Em segundo lugar, a profundidade de campo também depende de NA. Quanto maior o NA, menor a profundidade de campo. Isso dificulta o foco em objetos que não são totalmente planos. Se o NA ficar muito alto, você ficará limitado a lâminas de microscopia de imagem, que possuem amostras finas.

O posicionamento da parada de abertura entre as duas lentes torna o sistema praticamente telecêntrico. Isso significa que a ampliação do sistema é independente da distância do objeto. Isso se torna importante para juntar as imagens. Se o objeto tiver profundidade variável, a visão de duas posições diferentes terá a perspectiva alterada (como a visão humana). Costurar imagens que não sejam de um sistema de imagem telecêntrico é um desafio, especialmente com uma ampliação tão alta.

Use o acoplador reverso de lente de 58 mm a 52 mm para conectar a lente de 28 mm à lente de 80 mm com a abertura posicionada no meio.

Etapa 4: Design do Palco XY

Eu projetei o palco usando Fusion 360. Para cada direção de digitalização, há quatro partes que precisam ser impressas em 3D: montagem de montagem, dois extensores de unidade de slide e uma montagem de parafuso de chumbo. A base e as plataformas do estágio XY são cortadas a laser em compensado de 3 mm de espessura. A base contém o motor de direção X e os controles deslizantes, a plataforma X contém o motor de direção Y e os controles deslizantes, e a plataforma Y contém a amostra. A base consiste em 3 folhas e as duas plataformas consistem em 2 folhas. Os arquivos para corte a laser e impressão 3D são fornecidos nesta etapa. Depois de cortar e imprimir essas peças, você está pronto para as próximas etapas.

Etapa 5: Conjunto de montagem do motor

Usando uma ferramenta de enrolamento de fio, enrole o fio ao redor dos fios de dois emissores de infravermelho e dois receptores de infravermelho. Codifique os fios com cores para saber qual extremidade é qual. Em seguida, corte os condutores dos diodos, de modo que apenas os fios de arame sejam executados a partir de então. Deslize os fios pelas guias no suporte do motor e, em seguida, empurre os diodos no lugar. Os fios são direcionados para que não sejam visíveis até que saiam da parte traseira da unidade. Esses fios podem ser unidos aos fios do motor. Agora monte o motor de passo usando quatro parafusos M3. Repita esta etapa para o segundo motor.

Etapa 6: Montagem do Palco

Cole os cortes da Base 1 e da Base 2, um deles com aberturas hexagonais para as porcas M3. Assim que a cola secar, martele as porcas M3 na posição. As porcas não irão girar quando pressionadas na placa, então você poderá aparafusar os parafusos mais tarde. Agora cole a terceira folha de base (Base 3) para cobrir as porcas.

Agora é hora de montar a montagem da porca de chumbo. Remova qualquer filamento extra da montagem e, em seguida, empurre as quatro porcas M3 para a posição. Eles se encaixam bem, portanto, certifique-se de limpar o espaço do parafuso e da porca com uma pequena chave de fenda. Assim que as porcas estiverem alinhadas, empurre a porca de chumbo no suporte e prenda-a com 4 parafusos M3.

Anexe os blocos de almofada, montagens deslizantes e montagem do motor para o tradutor linear X-direção na base. Coloque o conjunto da porca de chumbo no parafuso de chumbo e, em seguida, deslize o parafuso de chumbo no lugar. Use o acoplador para conectar o motor ao parafuso principal. Coloque as unidades deslizantes nas hastes e, em seguida, empurre as hastes nos suportes deslizantes. Finalmente, prenda os extensores de montagem deslizante com parafusos M3.

As folhas de contraplacado X1 e X2 são coladas de forma semelhante à base. O mesmo procedimento é repetido para o tradutor linear na direção Y e o estágio de amostra.

Etapa 7: Eletrônicos do scanner

Cada motor de passo possui quatro cabos que são conectados a um módulo H-bridge. Os quatro cabos do emissor e receptor IR são conectados aos resistores de acordo com o diagrama acima. As saídas dos receptores são conectadas às entradas analógicas A0 e A1. Os dois módulos de ponte H são conectados ao pino 4-11 no Arduino Nano. Um botão de pressão é conectado ao pino 2 com um resistor de 1kOhm para uma entrada simples do usuário.

Por fim, o botão de disparo do dSLR é conectado a um obturador remoto, como fiz para o meu tomógrafo (consulte a etapa 7). Corte o cabo do obturador remoto. Os fios são identificados da seguinte forma:

Amarelo - foco

Vermelho - obturador

Branco - chão

Para focar o tiro, o fio amarelo deve ser conectado ao terra. Para tirar uma foto, os fios amarelo e vermelho devem estar conectados ao aterramento. Eu conectei um diodo e o cabo vermelho ao pino 12 e, em seguida, conectei outro diodo e o cabo amarelo ao pino 13. A configuração é conforme descrito em DIY Hacks and How-Tos instructable.

Etapa 8: Adquirir imagens Gigapixel

Em anexo está o código para o microscópio gigapixel. Usei a biblioteca Stepper para controlar os motores com a ponte H. No início do código, você deve especificar o campo de visão do microscópio e o número de imagens que deseja adquirir em cada direção.

Por exemplo, o microscópio que fiz tinha um campo de visão de cerca de 8,2 mm x 5,5 mm. Portanto, direcionei os motores para deslocarem 8 mm na direção xe 5 mm na direção y. São adquiridas 11 imagens em cada direção, totalizando 121 imagens para a imagem gigapixel completa (mais detalhes sobre isso na etapa 11). O código então calcula o número de etapas que os motores precisam realizar para traduzir o estágio por esse valor.

Como os estágios sabem onde estão em relação ao motor? Como os estágios são traduzidos sem atingir nenhuma das pontas? No código de configuração, escrevi uma função que move o palco em cada direção até quebrar o caminho entre o emissor de IR e o receptor de IR. Quando o sinal no receptor IR cai abaixo de algum limite, o motor para. O código então rastreia a posição do palco em relação a esta posição inicial. O código é escrito de forma que o motor não se transforme muito, o que faria o estágio funcionar na outra extremidade do parafuso de avanço.

Uma vez que o palco é calibrado em cada direção, o palco é transladado para o centro. Usando um tripé, posicionei meu microscópio dSLR sobre o palco. É importante alinhar o campo da câmera com as linhas cruzadas no palco da amostra. Uma vez que o palco está alinhado com a câmera, eu prendi o palco com um pouco de fita adesiva de pintor e coloquei a amostra no palco. O foco foi ajustado com a direção z do tripé. O usuário então pressiona o botão para iniciar a aquisição. O palco se traduz no canto esquerdo inferior e a câmera é acionada. O palco então varre a amostra, enquanto a câmera tira uma foto em cada posição.

Também está anexado algum código para a solução de problemas dos motores e sensores IV.

Etapa 9: unindo imagens

Com todas as imagens adquiridas, agora você se depara com o desafio de costurá-las todas juntas. Uma maneira de lidar com a costura de imagens é alinhar manualmente todas as imagens em um programa gráfico (usei o Gráfico da Autodesk). Isso certamente funcionará, mas pode ser um processo doloroso e as bordas das imagens são perceptíveis nas imagens em gigapixel.

Outra opção é usar técnicas de processamento de imagem para juntar as imagens automaticamente. A ideia é encontrar recursos semelhantes na seção sobreposta de imagens adjacentes e, em seguida, aplicar uma transformação de tradução à imagem para que as imagens fiquem alinhadas umas com as outras. Finalmente, as arestas podem ser combinadas multiplicando a seção sobreposta por um fator de peso linear e adicionando-as. Este pode ser um algoritmo difícil de escrever se você for novo no processamento de imagens. Trabalhei um pouco no problema, mas não consegui obter um resultado totalmente confiável. O algoritmo teve mais dificuldades com amostras que tinham características muito semelhantes, como os pontos na imagem da revista. Em anexo está o código que escrevi no Matlab, mas precisa de algum trabalho.

A última opção é usar programas de costura de fotografia de gigapixel. Não tenho nada a sugerir, mas sei que eles estão por aí.

Etapa 10: Desempenho do microscópio

Caso você tenha perdido, aqui estão os resultados: imagem de revista, toalha de mesa de crochê e eletrônicos diversos.

As especificações do sistema estão listadas na tabela acima. Tentei imagens com lentes de distância focal de 28 mm e 50 mm. Estimei a melhor resolução possível do sistema com base no limite de difração (cerca de 6μm). Na verdade, é difícil testar experimentalmente sem um alvo de alta resolução. Tentei imprimir um arquivo vetorial listado neste fórum de fotografia de grande formato, mas estava limitado pela resolução da minha impressora. O melhor que pude determinar com esta impressão foi que o sistema tinha resolução <40μm. Também procurei recursos pequenos e isolados nas amostras. A menor característica na impressão da revista é a mancha de tinta, que estimei também em cerca de 40μm, então não poderia usá-la para obter uma estimativa melhor para a resolução. Havia pequenos fragmentos na eletrônica que eram muito bem isolados. Como eu conhecia o campo de visão, pude contar o número de pixels ocupando o pequeno divot para obter uma estimativa da resolução, cerca de 10-15μm.

No geral, fiquei feliz com o desempenho do sistema, mas tenho algumas notas caso você queira experimentar este projeto.

Estabilidade do palco: Em primeiro lugar, obtenha componentes de palco linear de alta qualidade. Os componentes que usei tinham muito mais folga do que eu pensava. Eu só usei uma das montagens deslizantes no kit para cada haste, então talvez seja por isso que o palco não parecia muito estável. O palco funcionou bem o suficiente para mim, mas isso se tornaria um problema para sistemas de ampliação maiores.

Óptica para maior resolução: A mesma ideia pode ser usada para microscópios de maior ampliação. No entanto, serão necessários motores menores com etapas mais finas. Por exemplo, uma ampliação de 20X com este dSLR resultaria em um campo de visão de 1 mm (se o microscópio puder criar imagens de um sistema tão grande sem vinhetas). Electronupdate usou motores de passo de um CD player em uma bela construção para um microscópio de maior ampliação. Outra compensação será a profundidade de campo rasa, o que significa que a imagem será limitada a amostras finas e você precisará de um mecanismo de translação mais fino na direção z.

Estabilidade do tripé: este sistema funcionaria melhor com uma montagem de câmera mais estável. O sistema de lentes é pesado e o tripé é inclinado 90 graus em relação à posição para a qual foi projetado. Tive que prender os pés do tripé com fita adesiva para ajudar na estabilidade. O obturador também pode balançar a câmera o suficiente para desfocar as imagens.